اهميت pH در كروماتوگرافي مايع

اهميت تنظيم pH فاز متحرك:

امروزه كروماتوگرافي مايع پشتوانه بسياري از جداسازي ها در آزمايشگاههاي تحقيقاتي و صنايع دارويي است. اما به همان اندازه كه اين تكنيك از كارايي بالايي براي اين امر برخوردار است، نحوه بكارگيري آن شامل انتخاب صحيح فاز ساكن و متحرك،  بررسي آناليت مورد نظر از جهت سازگاري آن با HPLC، و رفع مشكلات عمومي آن از اهميت ويژه اي برخوردار است. لذا هدف از اين مقاله مروري بر مفاهيم بنيادي و مهم اين تكنيك و رفع برخي مشكلات پيش آمده در حين كار ميباشد.

نقش pH در بازداري تركيبات:

در كروماتوگرافي فاز معكوس (RP)، بازداري تركيبات بر اساس طبيعت آبگريز و غيرقطبي آناليت هاست. به اين معنا كه تركيبات قطبي تر تمايل كمتري به فاز ساكن غيرقطبي دارند و زودتر از ستون شسته شده و در نتيجه زمان بازداري كمتري دارند. بنابراين ترتيب شويش در كروماتوگرام به ترتيب از تركيبات قطبي به غير قطبي ميباشد.

در يك جداسازي اگر  تمام تركيبات خنثي باشند، pH فاز متحرك نقش موثري در جداسازي ايجاد نمي كند و مي توان از بهينه سازي آن صرف نظر كرد. اين شرايط در كرواتوگرام شكل 1 نشان داده شده است. در اين شكل پيك هاي ستاره دار مربوط به تركيبات خنثي بوده و همانطور كه مشاهده مي شود با تغيير pH از مقدار 3 به 7 تغييري در بازداري آنها ايجاد نمي گردد. اما هنگاميكه يك تركيب يونيزه شونده (اسيد يا باز) در مخلوط وجود داشته باشد،‌ تغيير pH تفاوت معناداري در بازداري ايجاد ميكند. در شكل 1 كربوكسيليك اسيدها به شدت در pH=7 يونيزه مي شوند و بار منفي ايجاد شده در اين تركيبات آنها را نسبت به pH=3 قطبي تر كرده و منجر به جابجايي معناداري در بازداري آنها مي شود.

شكل 1: كروماتوگرام بدست آمده از جداسازي 6 تركيب خنثي و 2 كربوكسيليك اسيد در pH=3,7

بازداري اسيدها و بازها عكس يكديگر است. اين مسئله از منحني بازداري pH (شكل 2) مشخص است. طبق شكل 2-a اسيدها در pH پايين بازداري خوب و در pH‌ بالا يازداري ضعيفي دارند به اين دليل كه در pH پايين اسيد حالت خنثي داشته در حالي كه در pH بالا يونيزه ميشود. اين قضيه براي بازها بالعكس است (شكل 2-b). نقطه مياني منحني هاي شكل 2، نقطه PKa است كه در آن نيمي از مولكولهاي گونه به صورت يونيزه و نيم ديگر آن غير يونيزه وجود دارند. لازم به ذكر است كه در نقطه PKa اگر چه هر دو حالت مولكول وجود دارد اما به دليل تعادل سريع بين اين دو فرم تنها يك 1يك واحد مشاهده ميشود. براي اسيدها وقتي pH در مقادير پايين تر از PKa تنظيم شود نسبت جز غير يونيزه به جز يونيزه افزايش يافته و در نتيجه قطبش كلي اسيد كاهش مي يابد و زمان بازداري بيشتر ميشود. همين فرآيند براي بازها در pHهاي بالا صادق است. با توجه به شكل 2 تغييرات يونيزاسيون در دامنه pH=PKa±1 معنادار بوده و در ابتدا و انتهاي منحني (pH=PKa ±2) بدليل اينكه اسيد يا باز به طور كامل يونيزه شده يا فرآيند يونيزاسيون متوقف مي شود، تغيير pH تغييري در يونيزاسيون نمونه ايجاد نمي كند. بنابراين اثر تغيير PH فاز متحرك بستگي به مقدار آن نسبت به PKa دارد. اين بدين معني است كه اگر مي خواهيم از pH به عنوان يك فاكتور براي تنظيم بازداري استفاده كنيم، تغييرات در حدود 5/1-1واحد كمتر يا بيشتر از PKa موثر خواهد بود.

شكل 2: منحني بازداري-pH براي a: تركيبات اسيدي b: تركيبات بازي

نقش pH در گزينش پذيري:

همانطور كه گفته شد اهميت واقعي بررسي pH فاز متحرك در هنگام توسعه يك روش براي مخلوط اسيدها و بازها در تفاوت ايجاد شده در بازداري تركيبات با تغيير pH است، بخصوص در موارديكه مقدار PKa تركيبات متفاوت باشد. شكل 3 جداسازي مخلوط 4 آنيلين كه در جدول 1 گزارش شده است را نشان ميدهد. با توجه به جدول، PKa‌تركيبات بين 98/3-66/2 است و طبق موارد گفته شده تغيير pH در 5/1 واحد كمتر و بيشتر از PKa موثر خواهد بود و بنابراين دامنه تغييرات بين 1/1 (5/1-66/2) و 5/5 (5/1+98/3) تعريف مي شود. اما از آنجاييكه كار در pH كمتر از 2 باعث آسيب به ستون مي شود ابتداي بازه 2 در نظر گرفته مي شود. با توجه به شكل 3 تغييرات pH در بازه تعريف شده تفاوت چشمگيري در گزينش پذيري جداسازي ايجاد مي كند.

لازم به ذكر است در موارديكه pH به عنوان يك فاكتور تاثيرگذار بررسي مي شود انتخاب يك pH كه استحكام روش را تضمين كند ضروري است. شكل 4 كروماتوگرام بدست آمده از جداسازي برخي اسيدها را نشان ميدهد كه pH=5.1 تمامي اسيدها به خوبي جدا شده اند (شكل 4-a) در حاليكه در pH=5.2 رو پيك آخر در هم ادغام شده اند. بنابراين با توجه به احتمال خطا در تنظيم pH انتخاب اين pH مطمئن نخواهد بود.

در انتخاب pH مطمئن و مناسب توجه به فاكتور بازداري (K) ضروري است كه مقدار آن در بازه 10-2  يا طبق برخي مراجع 20-1 مطلوب است. در شكل 3-a در pH 2 اگرچه جداسازي صورت گرفته ولي مقدار K براي دو پيك اول كمتر از يك است بنابراين احتمال تداخل پيكها وجود نخواهد داشت.

در pH=2.5 (شكل 3-b) مقدار K برابر با يك بدست آمده ضمن اينكه جداسازي هم بخوبي صورت گرفته. در pH=2.75 (در شكل گزارش نشده) جداسازي مشابه pH=2.5 انجام مي شود. ولي در pHهاي بالاار مجدداً تداخل پيك ها مشاهده مي گردد. بنابراين انتخاب pH در بازه 75/2-5/2 قابل اطمينان خواهد بود. در انتها لازم به ذكر است جهت تنظيم pH فاز متحرك حتماً از بافر مناسب (استات، فسفات و …) استفاده شود.