از كروماتوگرافي چه ميدانيد؟

در تمام شاخه‌هاي علوم کاربردهايي دارد. کرماتوگرافي گروه گوناگون و مهمي از روش‌هاي جداسازي مواد را شامل مي‌شود و امکان مي‌دهد تا اجزاي سازنده نزديک به هم مخلوط‌هاي کمپلکس را جدا ، منزوي و شناسايي کند بسياري از اين جداسازي‌ها به روش‌هاي ديگر ناممکن است.

سير تحولي رشد

• اولين روش‌هاي کروماتوگرافي در سال 1903 بوسيله ميخائيل سوئت ابداع و نامگذاري شد. او از اين روش براي جداسازي مواد رنگي استفاده کرد.

• مارتين و سينج در سال 1952 به پاس اکتشافاتشان در زمينه کروماتوگرافي جايزه نوبل دريافت کردند.

توصيف کروماتوگرافي

کروماتوگرافي را به دليل اينکه در برگيرنده سيستمها و تکنيکهاي مختلفي است نمي‌توان به طور مشخص تعريف کرد. اغلب جداسازي‌ها بر مبناي کروماتوگرافي بر روي مخلوطهايي از مواد بي‌رنگ از جمله گازها صورت مي‌گيرد. کروماتوگرافي متکي بر حرکت نسبي دو فاز است ولي در کروماتوگرافي يکي از فازها بدون حرکت است و فاز ساکن ناميده مي‌شود و ديگري را فاز متحرک مي‌نامند. اجزاي يک مخلوط به وسيله جرياني از يک فاز متحرک از داخل فاز ساکن عبور داده مي‌شود. جداسازي‌ها بر اساس اختلاف در سرعت مهاجرت اجزاي مختلف نمونه استوارند.

روش‌هاي کروماتوگرافي

روش‌هاي کروماتوگرافي را مي‌توان ابتدا بر حسب ماهيت فاز متحرک و سپس بر حسب ماهيت فاز ساکن طبقه‌بندي کرد. فاز متحرک ممکن است گاز يا مايع و فاز ساکن ممکن است جامد يا مايع باشد. بدين ترتيب فرآيند کروماتوگرافي به چهار بخش اصلي تقسيم مي شود. اگر فاز ساکن جامد باشد کروماتوگرافي را کروماتوگرافي جذب سطحي و اگر فاز ساکن ، مايع باشد کروماتوگرافي را تقسيمي مي‌نامند.

انواع کروماتوگرافي

هر يک از چهار نوع اصلي کروماتوگرافي انواع مختلف دارد:

کروماتوگرافي مايع – جامد

کروماتوگرافي جذب سطحي

کروماتوگرافي لايه نازک

کروماتوگرافي تبادل يوني

کروماتوگرافي ژلي

کروماتوگرافي گاز – جامد

کروماتوگرافي مايع – مايع

کروماتوگرافي تقسيمي

کروماتوگرافي کاغذي

کروماتوگرافي گاز- مايع

کروماتوگرافي گاز – مايع

کروماتوگرافي ستون مويين

مزيت روشهاي کروماتوگرافي

با روشهاي کروماتوگرافي مي‌توان جداسازي‌هايي را که به روش‌هاي ديگر خيلي مشکل مي‌باشند انجام داد. زيرا اختلافات جزئي موجود در رفتار جزئي اجسام در جريان عبور آنها از يک سيستم کروماتوگرافي چندين برابر مي‌شود‌. هر قدر اين اختلاف بيشتر شود قدرت جداسازي مواد بيشتر و براي انجام جداسازي مواد نياز کمتري به وجود اختلافات ديگر خواهد بود.

مزيت کروماتوگرافي نسبت به ستون تقطير اين است که نسبتا آسان مي‌توان به آن دست يافت با وجود اينکه ممکن است چندين روز طول بکشد تا يک ستون تقطير به حداکثر بازده خود برسد ولي يک جداسازي مواد کروماتوگرافي مي‌تواند در عرض چند دقيقه يا چند ساعت انجام گيرد.

يکي از مزاياي برجسته روش‌هاي کروماتوگرافي اين است که آنها آرام هستند. به اين معني که احتمال تجزيه مواد جداشونده به وسيله اين روش‌ها در مقايسه با ساير روش‌ها کمتر است.

مزيت ديگر روش‌هاي کروماتوگرافي در اين است که تنها مقدار بسيار کمي از مخلوط براي تجزيه لازم است به اين دليل روش‌هاي تجزيه‌اي مربوط به جداسازي مواد کروماتوگرافي مي‌توانند در مقياس ميکرو و نيمه ميکرو انجام گيرند.

روش‌هاي کروماتوگرافي ساده سريع و وسايل مورد لزوم آنها ارزان هستند. مخلوط‌هاي پيچيده را مي‌توان نسبتا به آساني به وسيله اين روش‌ها به دست آورد.

مواد

نوع کروماتوگرافي

مواد شيميايي مشابه

کروماتوگرافي تقسيمي

مواد شيميايي غير مشابه

کروماتوگرافي جذب سطحي

گازها و اجسام فرار

کروماتوگرافي گازي

مواد يوني و معدني

کروماتوگرافي تبادل يوني در ستون
کروماتوگرافي کاغذي يا لايه نازک
الکترفورز ناحيه‌اي

مواد يوني و غير يوني

کروماتوگرافي تبادل يون يا ژلي

مواد زيستيو ترکيباتي با جرم مولکولي نسبيبالا

کروماتوگرافي ژلي الکتروفورز

انتخاب بهترين روش کروماتوگرافي

انتخاب نوع روش کروماتوگرافي بجز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافي گازي در جداسازي مواد گازها) عموما تجربي است. زيرا هنوز هيچ راهي جهت پيش بيني بهترين روش براي جداسازي مواد اجسام مگر در چند مورد ساده وجود ندارد. در ابتدا روش‌هاي ساده‌تر مانند کروماتوگرافي کاغذي و لايه نازک امتحان مي‌شوند. زيرا اين روش‌ها در صورتي که مستقيما قادر به جداسازي مواد نباشند نوع سيستم کروماتوگرافي را که جداسازي مواد بوسيله آن بايد صورت بگيرد، مشخص مي‌کنند آنگاه در صورت لزوم از روش‌هاي پيچيده‌تر استفاده مي‌شود. از فهرست زير مي‌توان به عنوان يک راهنماي تقريبي استفاده کرد‌.

در جداسازي‌هاي مشکل وقتي که روش‌هاي ساده فاقد کارايي لازم هستند روش کروماتوگرافي مايع با کارايي بالا (HELC) مي تواند جوابگو باشد.

روش کروماتوگرافي (صعودي ، نزولي يا افقي)

تصميم گيري شخص آزمايش‌گر و وسايل موجود در مورد اينکه چه روشي براي يک آزمايش معين بايد به کار رود، احتمالا از نکات اوليه است. تناوب خيلي کمي در نتايج به دست آمده از کروماتوگرافي صعودي و نزولي وجود دارد ولي زمان صرف شده متفاوت است. زمان صرف شده عمدتا به نوع حلال و کاغذ بستگي دارد. ولي براي يک مجموعه مشخص کاغذ-حلال روش نزولي سريع‌تر از روش صعودي است. زمان عبور حلال در يک کرومتوگرام نزولي را با بريدن نوار کاغذ به طوري که يک فشردگي در بين مخزن و محل لکه نمونه به وجود آيد، مي‌توان افزايش داد.

براي جدا سازي‌هاي دو طرفه يا جدا سازي يک طرفه همزمان (صعودي) تعداد زيادي از نمونه‌هاي مختلف با همان حلال ، دستگاه قاب مربعي مناسب است. استفاده از ورقه‌ها و مخزن‌هاي بزرگ‌تر تنها زماني ضرورت دارد که عبور حلال به مسافت کم براي انجام کروماتوگرافي کافي به نظر نرسد، و در اين صورت روش نزولي بهتر خواهد‌ بود. براي جداسازي‌هاي کمي يا جداسازي‌هايي که در آنها تعادل دير برقرار مي‌شود، به نظر مي‌سد که روش نزولي مطلوب باشد، همچنين موقعي که احتياج به يک آزمايش طولاني باشد اين روش بهترين است. زيرا حلال مي‌تواند از انتهاي کاغذ لبريز شود.

نوع کاغذ

نقش اوليه کاغذ اين است که به عنوان نگه دارنده‌اي براي فاز ساکن عمل مي‌کند. سرعت عبور فاز متحرک بستگي به گرانروي اين فاز داشته و براي يک مخلوط حلال معين ، سرعت بستگي به |ساختار کاغذ|ماهيت فيزيکي کاغذ دارد. اگر براي افزايش چگالي ، الياف کاغذ نزديکتر به هم ساخته شوند، مساحت سطح آزاد و اندازه فضاها کاهش مي‌يابد و سرعت عبور کم مي‌شود. برعکس با ضخيم تر نمودن کاغذ بدون تغيير چگالي ، سرعت عبور افزايش مي‌يابد. در انتخاب کاغذ بايد تناسبي بين کارايي ماکسيمم و زمان لازم وجود داشته باشد.

انتخاب و تهيه حلال مناسب کروماتوگرافي

حلال متحرک معمولا مخلوطي است که شامل يک جزء اصلي آلي ، آب ، ترکيبات مختلف اضافه شده مانند اسيدها ، بازها يا عوامل کمپلکس کننده براي افزايش حلاليت بعضي از اجسام يا کاهش بعضي ديگر است. ممکن است ضد اکسنده‌ها نيز اضافه شوند. يک حلال معمولا بايد ارزان باشد، زيرا غالبا مقدار زيادي از آن مصرف مي شود، به طور خالص قابل تهيه باشد، و نبايد بيش از حد فرار باشد. زيرا در آن صورت احتياج به برقراري تعادل با دقت بيشتر است، از طرف ديگر فراريت زياد باعث مي‌شود که حلال از ورقه بعد از آزمايش آسان‌تر خارج مي شود و سرعت عبور آن به ميزان زياد تحت تاثير تغييرات دما نباشد.

تعادل در ظرف انتخاب شده

لازم است بررسي شود که تا چه حد مخلوط حلال اوليه و کاغذ ، قبل از شروع عمل ، بايد با محيط در حالت تعادل قرار بگيرند. زمان لازم براي به تعادل رسيدن محيط با حلال بستگي به اندازه مخزن و فراريت حلال دارد. اگر مخلوط‌هاي خيلي فرار به کار رود، تبخير از کاغذ سريع‌تر خواهد بود و برقراري تعادل حائز اهميت است.

تهيه نمونه

نمونه‌هاي جامد ، مانند خاک‌ها ، يا سلول‌هاي زيستي يا مواد بافتي را با حلال خيس مي‌کنند، يا از بعضي از روش‌هاي استاندارد استخراج استفاده مي‌کنند، نمونه‌هاي مهم زيادي مانند ادرار يا ساير مايعات زيستي در محيط‌هاي آبي هستند.

زمان عمل (گسترش) ، و مکان يابي و شناسايي

موفقيت يک جداسازي کروماتوگرافي در نهايت بستگي به فرآيند مکان‌يابي دارد. البته اجسام رنگي به صورت لکه‌هاي مجزا در آخر آزمايش قابل مشاهده هستند. اجسام بي‌رنگ احتياج به آشکارسازي شيميايي يا فيزيکي دارند. کروماتوگرافي‌ها را بايد قبل و بعد از اعمال هر روش ديگري به طور عادي زير نور فرابنفش بررسي کرد. روش فيزيکي که فقط براي مواد راديواکتيو قابل استفاده هستند، عبارت‌اند از پرتونگاري خودکار و شمارش.

روش‌هاي شيميايي آشکارسازي داراي بيشترين اهميت هستند و واکنشگرهاي به کار برده شده را معمولا واکنشگرهاي مکان ياب مي‌نامند. با انتخاب صحيح واکنشگر ، عمل آشکارسازي و شناسايي را مي‌توان به طور همزمان انجام داد. قسمتي از کاغذ را که شامل جسم مجهول است بريده و جسم را با يک حلال مناسب شستشو مي‌دهند محلول حاصل را مي‌توان به روش شيميايي بررسي کرد، يا مي‌توان يک سري مخلوط را ، که هر کدام از آنها متشکل از جسم شاهد است تهيه نموده و کروماتوگرام آنها را به دست آورد. به جز ماهيت کاغذ و حلال ، عوامل اصلي مؤثر بر جداسازي مواد عبارت ان از: دما ، اندازه ظرف ، زمان عمل و جهت جريان حلال ، موفقيت نهايي آزمايش بستگي به کارايي روش آشکارسازي دارد.

ارزيابي مواد روي کاغذ

مقايسه چشمي لکه :

محلول‌هاي شاهد ، داراي مقادير معلومي از جسم مورد نظر هستند، بايد از چندين محلول شاهد با غلظت‌هاي مختلف استفاده شود، هر يک از اين محلول‌ها تمام اجزاي موجود در محلول مورد آزمايش را داشته باشند. اين روش بستگي به استاندارد کردن خيلي دقيق دارد. در صورت استاندارد کردن ، اين روش ، مخصوصا در ارزيابي فلزات ، به طور شگفت آوري دقيق مي باشد.

اندازه گيري فيزيکي لکه‌هاي رنگي :

براي اندازه گيري مقدار ماده به کمک انعکاس يا به وسيله عبور نور از آنها مي‌توان از طيف سنج‌هاي نوري به طور مستقيم يا با اندکي تغيير استفاده کرد.

اندازه گيري مساحت لکه:

مساحت لکه متناسب با لگاريتم غلظت ماده در محلول اوليه مي‌باشد. اندازه گيري مساحت ، به علت فقدان مرز دقيق مشکل مي‌باشد.

اندازه گيري‌هاي پرتوزاي :

ساده ترين راه آشکار سازي اجسام پرتوزاي ، بررسي نوار ، و علامت گذاري محل لکه‌ها مي‌باشد.

کروماتوگرافي جذب سطحي

کروماتوگرافي جذب سطحي (Adsorption Chromatography) ، نمونه‌اي از کروماتوگرافي مايع – جامد است که در آن عمل جداسازي مواد بعلت متفاوت بودن جذب سطحي اجزاي مختلف مخلوط و فاز ساکن (جامد) انجام مي‌گيرد.

ستون کروماتوگرافي جذب سطحي

براي جداسازي مواد يک مخلوط ‏‏‏‎، مي‌توان از ستون استفاده کرد. داخل اين ستون با جامد فعالي مانند آلومين (فاز ساکن) پر شده است و با حلالي مانند هگزان (فاز متحرک) پوشيده شده است. هرگاه نمونه کوچکي از مخلوط در بالاي ستون قرار گيرد ، نواري از ماده جذب شده تشکيل مي‌شود، حلال با عبور خود از ميان ستون اجزاي مخلوط را با خود حمل مي‌کند.

جداسازي کامل

سرعت حرکت هر جزء‏ ، به ميزان جذب سطحي آن بر روي ماده داخل ستون بستگي دارد. به اين ترتيب ، ماده‌اي که کم جذب شده است، سريع‌تر از ماده‌اي که زياد جذب شده است، حرکت مي‌کند. واضح است که اگر اختلاف بين جذب‌هاي سطحي به حد کافي زياد باشد، جداسازي مواد کامل انجام خواهد گرفت. اجزايي که قابليت جذب بالاتري دارند، در قسمت بالاي ستون و اجسامي که کمتر جذب مي‌شوند در قسمت‌هاي پايين ستون ، جذب خواهند شد.

نيروهاي بين اجزا

اين نيروها ممکن است يا از نوع نيروهاي واندروالسي ، مانند نيروهايي که در مورد آلومين است يا از نوع نيروهاي الکترستاتيک باشند، مانند جداسازي يون‌ها بوسيله کروماتوگرافي تبادل يوني که در آن فاز ساکن يک ماده مبادله کننده يون است ، يا ممکن است از يک ستون که از ماده مناسب متخلخلي پر شده، براي جدا کردن مواد حل‌شده بر اساس اندازه مولکول آنها استفاده کرد، مانند کروماتوگرافي ژلي.

کروماتوگرافي لايه نازک نمونه ويژه‌اي از کروماتوگرافي جذب سطحي است که در اين روش ، به جاي اينکه جاذب را در يک ستون استوانه‌اي پر کنيم، آن را بصورت لايه نازک روي يک صفحه شيشه‌اي يا لايه پلاستيکي يا ورقه فلزي قرار مي‌دهيم.

مقايسه با کروماتوگرافي تقسيمي

روش‌هاي جذب سطحي ، براي جداسازي مواد انواع مختلف ترکيبات شيميايي بهتر هستند. ظرفيت يک ستون جذب سطحي ، در واحد حجم ، غالبا بزرگتر از ظرفيت يک ستون تقسيمي بوده و گاهي اين اختلاف خيلي زياد است.

کروماتوگرافي تقسيمي

کروماتوگرافي تقسيمي نمونه‌اي از کروماتوگرافي مايع-مايع است که فاز جامد يک لايه از محلول ( مثل آب ) است که روي سطح يک جامد ناصاف مثل سيليکاژل و يا خاک سيليسي قرار دارد و فاز متحرک مايعي است که غير محلول در مايع اولي مي‌باشد.

اطلاعات اوليه

در جداسازي مواد بوسيله کروماتوگرافي تقسيمي در ستون ، شيوه کار بسيار شبيه به شيوه کروماتوگرافي جذب سطحي است. اختلاف اصلي دو روش در ماهيت ماده پر شده در ستون است.

اساس کار کروماتوگرافي تقسيمي

سرعت حرکت يک جزء از مخلوط تابع انحلال پذيري آن در فاز ساکن است. به عبارت ديگر ، جدا شدن اجزا بر اساس تقسيم بين دو مايع است. اجسامي که بيشتر حل مي‌شوند، کندتر از اجسامي که کمتر حل مي‌شوند به طرف پايين ستون حرکت مي‌کنند. در جريان عبور از ستون ، اجسام ميان دو فاز تقسيم مي‌شوند و جداسازي مواد بر اساس اختلاف ميان ضرايب تقسيم آنها انجام مي‌شوند.

يک مورد خاص

کروماتوگرافي کاغذي مورد خاصي از کروماتوگرافي تقسيمي به شمار مي‌رود که در آن صفحات کاغذي جاي ستون پر شده را مي‌گيرند.

خصوصيات

يکي از خصوصيات اساسي کروماتوگرافي اين است که مخلوط اجسام ابتدا به صورت يک نوار در ستون که در نتيجه جذب سطحي يا جذب به وسيله فاز ساکن به وجود مي‌آيد، ظاهر مي‌شود. براي جداسازي مواد اجزاي بايد عمل ديگر روي نوار انجام گيرد. تجزيه به روش‌هاي گوناگوني انجام مي‌گيرد.

مقايسه با کروماتوگرافي جذب سطحي

مي‌توان گفت که روش‌هاي تقسيمي براي جداسازي ترکيبات شيميايي نزديک به هم ، مانند اعضاي سري‌هاي ترکيبات مشابه ، مناسب‌تر است. مزيت اصلي روش تقسيمي اين است که نوارهاي کروماتوگرافي حاصل ، به علت وجود دنباله ، نسبتا باريک و در نتيجه استفاده از ستون‌ها کارآمدتر است. ظرفيت يک ستون تقسيمي ، در واحد حجم ، غالبا کوچک‌تر از ظرفيت يک ستون جذب سطحي بوده و گاهي اين اختلاف خيلي زياد است.

کروماتوگرافي کاغذي (paper chromatoghraphy)

اطلاعات اوليه

انواع جداسازي‌هاي مختلف و ساده بر روي کاغذ به عنوان پيشروان کروماتوگرافي کاغذي توصيف شده‌اند. اين سيستم معمولا به عنوان نمونه بارزي از سيستم تقسيمي در نظر گرفته مي‌شود که در آن فاز ساکن آب است و به وسيله جذب سطحي بر روي مولکول‌هاي سلولز قرار مي‌گيرد و مولکول‌هاي سلولز نيز به نوبه خود به وسيله ساختار اليافي کاغذ در وضعيت‌هاي ثابت نگه داشته مي‌شود. امروزه ، به هر حال ، مشخص شده است که جذب سطحي اجزاي فاز متحرک و حل شونده‌ها و اثرات تبادل يون نيز نقش‌هايي را ايفا مي‌کنند و کاغذ به هيچ عنوان تنها به صورت تکيه گاه بي اثر نيست.

سير تحولي رشد

روش پيشنهادي رانگ در سال 1850 و فرآيندي که آن را تجزيه موئينه‌اي مي‌نامند، از جمله آنها مي‌باشند. چنين روش‌هايي در واقع بيشتر شبيه کروماتوگرافي جذب سطحي بودند و کروماتوگرافي کاغذي به مفهوم فعلي ، گسترش سيستم تقسيمي است که به وسيله مارتين و سينج در سال 1941 ارائه شد. در سال 1944 کونسدن ، گوردن و مارتين اسيدهاي آمينه و پپتيدهاي موجود در محصول آبکافت ، پروتئين پشم را به وسيله روشي جدا کردند که در آن به جاي ستون پودر از يک صفحه يا نوار کاغذي آويزان در داخل يک ظرف سرپوش‌دار استفاده شده بود.

کاربرد

در ابتدا کروماتوگرافي کاغذي براي جداسازي مخلوط‌هاي مواد آلي به کار رفت. ولي بعد از آن ، عمدتا به وسيله برستال و پولارد و همکاران آنها ، براي جداسازي يون‌هاي معدني به سرعت به کار گرفته شد. هم آنيون‌ها و هم کاتيون‌ها را به وسيله اين روش مي‌توان جدا کرد.

خصوصيت ويژه

يک خصوصيت ويژه روش کروماتوگرافي کاغذي اين است که چيزي مربوط به محلول يا گاز خارج شده از ستون که در سيستم‌هاي معمول مايع يا گاز با آن برخورد مي‌کنيم وجود ندارد. ترکيبات جدا شده روي کاغذ مکان‌يابي و شناسايي مي‌شوند در نتيجه ، جداسازي به طور نسبتا دائم در روي کاغذ ثبت مي‌شود. در اين روش اجزاي جدا شده جمع آوري نمي‌شوند و احتياجي به وسايل پيچيده کنترل پيوسته نيست. اندازه گيري کمي ترکيبات جدا شده را مي‌توان روي کاغذ انجام داد ولي اگر بخواهند اجراي را از کاغذ خارج کنند. تنها کار لازم اين است که قسمت مربوط به هر يک از اجسام را از کاغذ ببرند و هر يک را به طور جداگانه بشويند.

طرح کلي روش

قطره‌اي از محلولحاوي مخلوطي که بايد جدا شود را روي يک صفحه يا نوار کاغذ صافي در محل علامت گذاري شده قرار مي‌دهند. در اين محل ، قطره به صورت يک لکه حلقوي پخش مي‌شود. وقتي که لکه خشک شده کاغذ را در يک ظرف مناسب سربسته طوري قرار دهند که يک سر آن در حلال انتخاب شده به عنوان فاز متحرک فرو رود. حلال از طريق الياف کاغذ در نتيجه عمل موئينگي نفوذ مي‌کند و نکته مهم اين است که سطح کاغذ نبايد کاملا به وسيله حلال پوشانده شود. زيرا در اين صورت ، اصلا جدا سازي صورت نمي‌گيرد يا نواحي خيلي پخش مي‌شوند.

وقتي که جبهه حلال مسافت مناسبي را طي کرد يا بعد از يک زمان از قبل تعيين شده ، کاغذ را از طرف بيرون آورده ، جبهه حلال را با علامتي مشخص مي‌کنند و مي‌گذارند تا صفحه خشک شود. وقتي که محل‌هاي مناطق جدا شده آشکار شدند لازم است که هر يک از اجسام به طور جداگانه شناسايي شوند. در موارد ايده‌آل ، هر جسم با واکنشگر مکان‌ياب ، رنگ مخصوصي مي‌دهد که در مورد مواد معدني بيشتر و درمورد مواد آلي کمتر مشاهده مي‌شود. ساده‌ترين روش شناسايي بر اساس مقدار Rf يعني نسبت فاصله طي شده به وسيله جبهه حلال است.

خارج کردن جسم از کاغذ

روش‌هاي ارائه شده مستلزم به کارگيري يک واکنشگر مکان ياب شيميايي براي تعيين محل لکه هستند، و لکه‌هاي رنگي اساس ارزيابي را تشکيل مي‌دهند. بعضي اوقات مي‌توان کمپلکس را شستشو داد و به وسيله روش رنگ سنجي تخمين زد، ولي اگر تغيير شيميايي قابل قبول نباشد ماده تغيير نيافته را بايد شستشو داد. عمل شستشو را مي‌توان با وارد کردن تکه کاغذ در يک حلال ، به وسيله استخراج در يک دستگاه سوکسيله ، يا با استفاده از آرايش خاصي ، که در کاغذ يک جريان نزولي کروماتوگرافي ايجاد مي‌نمايد، انجام داد. براي جداسازي‌هاي معدني تکه‌هاي کاغذ را مي‌توان به صورت خاکستر در آورده ، باقيمانده‌ها را در اسيد حل کرد. نتايج اين روش به اندازه روش شستشو خوب نيستند. از اينرو محلول‌هاي به دست آمده را مي‌توان به وسيله هر روش مناسبي تجزيه کرد، روش‌هايي که اغلب به دنبال روش‌هاي کروماتوگرافي به کار مي‌روند عبارتند از رنگ سنجي و قطبش نگاري.

پيدا کردن يک روش کروماتوگرافي ، که بتواند به طور کمي تمامي اجزاي يک مخلوط را جدا کند، مطلقا ضروري نيست. ارزيابي کمي فلزات با قطبش نگاري و ارزيابي کمي مواد آلي مشکل‌تر از فلزات است زيرا ، براي مواد آلي ، روش‌هاي موجود براي آزمايش محلول حاصل از شستشو محدودتر هستند. ارزيابي مواد آلي معمولا بر روي کاغذ صورت مي‌گيرند و بنابراين ، لازم است که هر جسمي از اجسام ديگر به طور کمي جدا شود.

نقايص کروماتوگرافي کاغذي

لکه‌هاي چند تايي :

در کروماتوگرافي يون‌ها فلزي ، اگر داراي آنيوني متفاوت از آنيون موجود در محلول اوليه باشد، ممکن است رقابتي بين آنيون‌ها براي يون فلزي وجود داشته باشد، که در نتيجه دو لکه به دست مي‌آيد که هر يک از آنها مربوط به يکي از نمکهاي فلزي مي‌باشد. ممکن است يون فلزي دو کمپلکس متفاوت با حلال ايجاد کند. در جدا سازي‌هاي آلي ، ممکن است جسم دو شکل متفاوت وجود داشته باشد. به عنوان مثال يک آمينو اسيد مي‌تواند به صورت کاتيون و يون دو قطبي باشد.

دنباله دار شدن :

اگر مخلوط يه مقدار زياد از حد روي کاغذ قرار داده شود، يا سرعت عبور حلال متفاوت باشد، جسم نمي‌تواند براي ايجاد يک لکه مجزا به تعادل برسد. در اين صورت اين لکه ، در سطح بزرگي از کاغذ پخش شده و از حلال در حال پيشروي عقب مي‌ماند. دنباله‌دار شدن ممکن است به سبب اثرات جذبي سطحي تر ايجاد شود.

اثرات لبه يا کناره :

لکه‌ها خيلي نزديک به کنار نوار ، ممکن است در امتداد کنار کاغذ پخش شوند، عمل نفوذ ممکن است به علت بالا بودن غلظت موضعي فاز متحرک در آن ناحيه ، و يا به علت بالاتر بودن سرعت تبخير حلال در کنار کاغذ ، که منجر به اثرات تقسيمي غيرعادي مي‌شوند، باشد.

روش کمي کروماتوگرافي کاغذي

کاربرد کمي اين روش نه تنها احتياج به يک جداسازي کمي ، بلکه مکان‌يابي و ارزيابي کمي اجسام موجود نيز دارد. يک جداسازي کيفي رضايت بخش ، الزاما براي کار کمي مفيد نيست. اندازه گيري کمي را مي‌توان يا با سنجش مقدار جسم موجود در لکه روي کاغذ ، يا با خارج کردن جسم از کاغذ و تجزيه اجزاي جدا شده به وسيله روش‌هاي کمي متداول انجام داد. لکه اوليه از نمونه مناسب روي کاغذ قرار مي‌دهند، خشک کردن لکه بايد تحت شرايط استاندارد زمان و دما صورت گيرد.

در تهيه حلال بايد دقت زيادي روي نسبت‌هاي اجزاي صورت گيرد، برقرار ساختن تعادل بايد به طور استاندارد انجام گيرد، طول عبور حلال در تمامي نوبت‌ها يکسان باشد، در طول آزمايش ، دما بايد ثابت بماند، و خشک کردن ورقه بايد در يک زمان و دماي استاندارد انجام گيرد. واکنشگر مکان‌ياب (در صورت استفاده از لکه‌هاي رنگي) بايد به طريق کاملا تکرارپذير افزوده شود. و هر عمل بعدي ، مانند خشک کردن يا قراردادن در معرض بخار آمونياک ، بايد در مدت استاندارد انجام گيرد. مقدار جسمي که در يک جداسازي کروماتوگرافي بايد روي کاغذ قرار گيرد، متغير است.

موارد استعمال کروماتوگرافي کاغذي

منابع علمي مربوط به روش‌هاي تجزيه‌اي و بررسي ترکيبات طبيعي نشان مي‌دهد که کروماتوگرافي کاغذي در هر رشته‌اي کاربرد دارد. با اين همه ، اين روش هنوز هم در جداسازي‌هاي مواد با ماهيت زيستي وسيعترين کاربرد را دارد.

کروماتوگرافي کاغذي اکثرا به عنوان يک وسيله تحقيقاتي به کار مي‌رود، و به طور گسترده‌اي در تجزيه‌هاي روزمره مخصوصا در جداسازي‌هاي جديدي که هيچ روش کلاسيک براي آنها وجود ندارد، نيز مورد استفاده قرار مي گيرد. روش اخير در مسائل کلينيکي و زيست شيميايي ، جداسازي اسيدهاي آمينه و پپتيدها در بررسي ساختارهاي پروتئين کاربد دارد.

آزمايش روزمره ادرار و ساير مايعات بدن براي اسيد آمينه و قند ، جداسازي بازهاي پورين و نوکلئوتيدها در آزمايش اسيدهاي نوکلئيک ، جداسازي استرئيدها ، تجزيه عمومي ، تجزيه بسپارها ، تشخيص و ارزيابي فلزات در خاک ها و نمونه هاي زمين شناسي ، بررسي ترکيبات فنلي در عصاره هاي گياهي ، جداسازي آلکالوئيدها ، جداسازي ترکيبات علامت دار به وسيله راديو ايزوتوپ‌ها ، کروماتوگرافي کاغذي براي جداسازي مواد فرار غير فعال مانند هيدروکربن‌ها و ديگري جداسازي اسيدهاي چرب با فراريت بيشتر مناسب نمي باشد.

نکات بارز کروماتوگرافي کاغذي

روش کروماتوگرافي (صعودي ، نزولي يا افقي)

تصميم گيري شخص آزمايش‌گر و وسايل موجود در مورد اينکه چه روشي براي يک آزمايش معين بايد به کار رود، احتمالا از نکات اوليه است. تناوب خيلي کمي در نتايج به دست آمده از کروماتوگرافي صعودي و نزولي وجود دارد ولي زمان صرف شده متفاوت است. زمان صرف شده عمدتا به نوع حلال و کاغذ بستگي دارد. ولي براي يک مجموعه مشخص کاغذ-حلال روش نزولي سريع‌تر از روش صعودي است. زمان عبور حلال در يک کرومتوگرام نزولي را با بريدن نوار کاغذ به طوري که يک فشردگي در بين مخزن و محل لکه نمونه به وجود آيد، مي‌توان افزايش داد.

براي جدا سازي‌هاي دو طرفه يا جدا سازي يک طرفه همزمان (صعودي) تعداد زيادي از نمونه‌هاي مختلف با همان حلال ، دستگاه قاب مربعي مناسب است. استفاده از ورقه‌ها و مخزن‌هاي بزرگ‌تر تنها زماني ضرورت دارد که عبور حلال به مسافت کم براي انجام کروماتوگرافي کافي به نظر نرسد، و در اين صورت روش نزولي بهتر خواهد‌ بود. براي جداسازي‌هاي کمي يا جداسازي‌هايي که در آنها تعادل دير برقرار مي‌شود، به نظر مي‌سد که روش نزولي مطلوب باشد، همچنين موقعي که احتياج به يک آزمايش طولاني باشد اين روش بهترين است. زيرا حلال مي‌تواند از انتهاي کاغذ لبريز شود.

نوع کاغذ

نقش اوليه کاغذ اين است که به عنوان نگه دارنده‌اي براي فاز ساکن عمل مي‌کند. سرعت عبور فاز متحرک بستگي به گرانروي اين فاز داشته و براي يک مخلوط حلال معين ، سرعت بستگي به |ساختار کاغذ|ماهيت فيزيکي کاغذ دارد. اگر براي افزايش چگالي ، الياف کاغذ نزديکتر به هم ساخته شوند، مساحت سطح آزاد و اندازه فضاها کاهش مي‌يابد و سرعت عبور کم مي‌شود. برعکس با ضخيم تر نمودن کاغذ بدون تغيير چگالي ، سرعت عبور افزايش مي‌يابد. در انتخاب کاغذ بايد تناسبي بين کارايي ماکسيمم و زمان لازم وجود داشته باشد.

انتخاب و تهيه حلال مناسب کروماتوگرافي

حلال متحرک معمولا مخلوطي است که شامل يک جزء اصلي آلي ، آب ، ترکيبات مختلف اضافه شده مانند اسيدها ، بازها يا عوامل کمپلکس کننده براي افزايش حلاليت بعضي از اجسام يا کاهش بعضي ديگر است. ممکن است ضد اکسنده‌ها نيز اضافه شوند. يک حلال معمولا بايد ارزان باشد، زيرا غالبا مقدار زيادي از آن مصرف مي شود، به طور خالص قابل تهيه باشد، و نبايد بيش از حد فرار باشد. زيرا در آن صورت احتياج به برقراري تعادل با دقت بيشتر است، از طرف ديگر فراريت زياد باعث مي‌شود که حلال از ورقه بعد از آزمايش آسان‌تر خارج مي شود و سرعت عبور آن به ميزان زياد تحت تاثير تغييرات دما نباشد.

تعادل در ظرف انتخاب شده

لازم است بررسي شود که تا چه حد مخلوط حلال اوليه و کاغذ ، قبل از شروع عمل ، بايد با محيط در حالت تعادل قرار بگيرند. زمان لازم براي به تعادل رسيدن محيط با حلال بستگي به اندازه مخزن و فراريت حلال دارد. اگر مخلوط‌هاي خيلي فرار به کار رود، تبخير از کاغذ سريع‌تر خواهد بود و برقراري تعادل حائز اهميت است.

تهيه نمونه

نمونه‌هاي جامد ، مانند خاک‌ها ، يا سلول‌هاي زيستي يا مواد بافتي را با حلال خيس مي‌کنند، يا از بعضي از روش‌هاي استاندارد استخراج استفاده مي‌کنند، نمونه‌هاي مهم زيادي مانند ادرار يا ساير مايعات زيستي در محيط‌هاي آبي هستند.

زمان عمل (گسترش) ، و مکان يابي و شناسايي

موفقيت يک جداسازي کروماتوگرافي در نهايت بستگي به فرآيند مکان‌يابي دارد. البته اجسام رنگي به صورت لکه‌هاي مجزا در آخر آزمايش قابل مشاهده هستند. اجسام بي‌رنگ احتياج به آشکارسازي شيميايي يا فيزيکي دارند. کروماتوگرافي‌ها را بايد قبل و بعد از اعمال هر روش ديگري به طور عادي زير نور فرابنفش بررسي کرد. روش فيزيکي که فقط براي مواد راديواکتيو قابل استفاده هستند، عبارت‌اند از پرتونگاري خودکار و شمارش.

روش‌هاي شيميايي آشکارسازي داراي بيشترين اهميت هستند و واکنشگرهاي به کار برده شده را معمولا واکنشگرهاي مکان ياب مي‌نامند. با انتخاب صحيح واکنشگر ، عمل آشکارسازي و شناسايي را مي‌توان به طور همزمان انجام داد. قسمتي از کاغذ را که شامل جسم مجهول است بريده و جسم را با يک حلال مناسب شستشو مي‌دهند محلول حاصل را مي‌توان به روش شيميايي بررسي کرد، يا مي‌توان يک سري مخلوط را ، که هر کدام از آنها متشکل از جسم شاهد است تهيه نموده و کروماتوگرام آنها را به دست آورد. به جز ماهيت کاغذ و حلال ، عوامل اصلي مؤثر بر جداسازي مواد عبارت ان از: دما ، اندازه ظرف ، زمان عمل و جهت جريان حلال ، موفقيت نهايي آزمايش بستگي به کارايي روش آشکارسازي دارد.

ارزيابي مواد روي کاغذ

مقايسه چشمي لکه :

محلول‌هاي شاهد ، داراي مقادير معلومي از جسم مورد نظر هستند، بايد از چندين محلول شاهد با غلظت‌هاي مختلف استفاده شود، هر يک از اين محلول‌ها تمام اجزاي موجود در محلول مورد آزمايش را داشته باشند. اين روش بستگي به استاندارد کردن خيلي دقيق دارد. در صورت استاندارد کردن ، اين روش ، مخصوصا در ارزيابي فلزات ، به طور شگفت آوري دقيق مي باشد.

اندازه گيري فيزيکي لکه‌هاي رنگي :

براي اندازه گيري مقدار ماده به کمک انعکاس يا به وسيله عبور نور از آنها مي‌توان از طيف سنج‌هاي نوري به طور مستقيم يا با اندکي تغيير استفاده کرد.

اندازه گيري مساحت لکه :

مساحت لکه متناسب با لگاريتم غلظت ماده در محلول اوليه مي‌باشد. اندازه گيري مساحت ، به علت فقدان مرز دقيق مشکل مي‌باشد.

اندازه گيري‌هاي پرتوزاي :

ساده ترين راه آشکار سازي اجسام پرتوزاي ، بررسي نوار ، و علامت گذاري محل لکه‌ها مي‌باشد.

کروماتوگرافي

کروماتوگرافي روش جزء به جزء کردن يک مخلوط براساس قطبيت مولکول ها مي باشد.کروماتوگرافي شامل يک فاز متحرک(مخلوط) مي باشد که مي خواهيم جداسازي نماييم واين مخلوط دريک مايع ويا گاز حل شده است و ازروي يک فاز ساکن عبور مي نمايد اجسام موجود در مخلوط به علت قطبيت متفاوت با سرعت هاي مختلف ازروي فاز ساکن مي گذرند .

سرعت حرکت هر جزء درمخلوط به چند عامل قطبيت بستگي دارد که مهمترين آنها يک جسم قطبي هم به حلال وهم به فازساکن جاذبه دارد جسمي که کندتر حرکت مي کند بيشترين جاذبه رانسبت به فاز ساکن دارد.

کروماتوگرافي انواع گوناگون دارد

ازجمله :

1- کروماتوگرافي ستوني :

که براي جداسازي هاي فوق العاده حساس مانند جداسازي ويتامين ها ٬ پروتئين ها ٬ وهورمون هابه کار مي رود. که باروش هاي ديگربه آساني جدا سازي نمي شوند. در اين روش فاز ساکن شامل يک ستون شيشه اي ياپلاستيکي است. که باماده اي نظير آلومينيم اکسيد ٬ کلسيم کربنات٬ منيزيم کربنات٬ زغال فعال شده٬ خاک رس٬ ژل ها و يا بسياري ازترکيبات آلي ديگر پر شده است. اندازه ذرات فازساکن درگستره( 150 تا 200μm ) مي باشد. فاز متحرک شامل مخلوط همراه بايک حلال مناسب است که ازبالاي ستون اضافه مي شود .

2- کروماتوگرافي يوني

: دراين مورد ستون رااز رزين تبادل يون پر مي کنند. بابه کاربردن رزين مناسب مي توان يون هاي مثبت ويون هاي منفي راازهم جدانمود .

3- کروماتوگرافي کاغذي :

دراين روش به جاي ستون شيشه اي از نوارهاي کاغذي درظرف سربسته استفاده مي شود قطره اي ازمخلوط رابرروي کاغذ گذاشته وانتهاي کاغذرادرحلال مناسب قرار مي دهند حلال براساس خاصيت موئينگي درکاغذ نفوذ نموده وباعث جداسازي اجزاء مخلوط مي شود برديدن چگونگي اين نوع کروماتوگرافي دراينجا کليک نماييد.

4- کروماتوگرافي لايه نازک:

اين تکنيک که غالبا درجداسازي مخلوطهاي مواد زيست شناختي مختلف به کار مي رود بعضي ازتکنيک واصول به کاررفته درکروماتوگرافي ستوني وکاغذي باهم تلفيق شده است .

5- کروماتوگرافي گازي :

يک تکنيک کروماتوگرافي براي تجزيه مايعات فرارومخلوط هايي ازگازهاو بخارات مي باشد .گازهاي که بايد تفکيک شوند همراه با يک گاز بي اثر نظير هليم درفاز متحرک حمل مي شود.

روش هاي کروماتوگرافي

دسته اي از روشهاي جداسازي هستند که براي جداسازي اجزاي نمونه بکار مي روند.در اين روشها نمونه بين دو فاز مختلف توزيع مي شد و در اثر رقابتي که بين فازها براي نمونه وجود دارد عمل جداسازي صورت ميگيرد.

نمونه معمولا روي فاز ساکن قرار ميگيرد و فاز متحرک از روي فاز ساکن حرکت کرده مي خوهد نمونه را با خود ببرد اما فاز ساکن نمي گذارد. رقابت بوجود امده مبناي جداسازيست

فاز ساکن مي تواند جامع يا مايع و فاز متحرک مي تواند گاز يا مايع باشد

فاز ساکن در حالت جامد بايد داراي سطح وسيع باشد. در حات مايع انرا بر سطح يک جامد بي اثر پوشش مي دهند.

سمت راست جامد و سمت چپ مايع است

مکانيسم کروماتوگرافي را فاز ساکن تعيين مي کند.اگر فاز ساکن جامد باشد مکانيسم جدب سطحي است و اگر مايع باشد مکانيسم تفکيکيست(نمونه بين فاز ساکن و متحرک تقسيم مي شد)

کروماتوگرافي به صورت زير طبقه بندي مي شود

زرد رنگ جذب سطحي/قرمز رنگ تفکيکي/ابي مکانيسم تعويض يون

کاغذي paper

ابتدا روي کاغذ مخصوص خطي رسم کرده و يک نقطه از ماده ي مورد نظر روي خط قرار مي دهيم(نقطه ي بنفش رنگ)که بهتر است تا حد ممکن کوچک باشدسپس کاغذ را به صورت عمودي در ظرفي حاوي حلال قرار ميدهيم.حلال به ارامي از کاغذ بالا ميرود. در کروماتو گرافي کاغذي فاز ساکن اب است نه کاغذ(مايع-مايع) فاز ساکن فاز تعيين کننده است که يا اجازه ي حرکت به نمونه مي دهد يا نمي دهد و اين همان عامل جداسازيست. ميزان حرکت لکه ها مي تواند اساس اندازه گيري يا شناسايي باشد. براي تشخيص اينکه کدام ماده A است و کدام B از يک سري استاندارد استفاده ميشود به شرط انکه بدانيم A وB به کدام دسته از ترکيبات (امينو اسيد و…) تعلق دارند.

R = “فاصله اي که جسم طي کرده” تقسيم بر “فاصله اي که حلال طي کرده”

در شرايط ثابت R يک کميت ثابت است

ظاهر کردن لکه

اگر لکه رنگي باشد راحت ديده ميشود اما اگر بيرنگ باشد بايد از روشهاي زير استفاده کرد

1- معرفهاي شيميايي : وجود ماده را مشخص ميکنند اما باعث ميشوند ماده تخريب يا عوض شود مثلا براي اسيدهاي امينه از ترکيبات نينهيدرين استفاده مي شود که با انها کمپلکس رنگي ميدهد

2-لامپ uv : برخي موادفلورسانس ميکنند اما اگر ماده فلورسانس نداشت از کاغذ فلورسانس استفاده ميکنند به اين ترتيب قسمتهايي که لکه وجود دارد فلورسانس نيست. ميتوان لکه را مشخص کرد (دور ان خط ميکشند) در اين روش ماده هم از بين نمي رود

مي توان لکه را بريد و بعد در حلال انداخت تا ماده در ان حل شود و بعد اقدام به شناسايي ماده کرد البته در اين صورت به ماده ي زيادي نياز دارين و علاوه بر اين يافتن حلال مناسب سخت است و حتي گاهي تا 50 سيستم را بايد امتحان کرد.

روشهاي تجزيه ي کيفي=> شناسايي بعد از جداسازي:

1/مقايسه R مجهول با R مواد معلوم

2/IR و NMR و mass

روشهاي تجزيه کمي:

1/طيف سنجي uv

2/اسپکتروسکوپي انعکاسي

لايه نازک

عمليات کروماتوگرافي لايه نازک مانند کاعذ است.

فاز ساکن يک جامد است که به صورت يک لايه ي نازک روي يک صفحه ي فلزي يا شيشه اي قرار گرفته است. اين فاز ساکن مي تواند سيليکاژل (SiO2 هيدراته) , الومينا (Al2O3), ÷لي مر و … باشد

حسن اين روش نسبت به کاغذ عمومي تر بودن مواد شيميايي براي ظاهر کردن لکه ها در اين روش است. مثلا يد و اسيد سولفوريک که در کروماتوگرافي لايه نازک براي ظاهر کردن لکه ها بکار مي روند در کروماتوگرافي کاغذ قابل استفاده نيستند

در اين روش مي توان محل لکه را تراشيد و در حلال انداخت.

کروماتوگرافي کاغذ gas chromatography

فاز ساکن يک مايع است که بر سطح مواد جامد بي اثر پوشش داده شده و درون يک ستون فرار دارد. فاز متحرک نيز يک گاز است.

اين کروماتوگرافي به دستگاه نياز دارد. اين دستگاه شامل:

سيلندر گاز بي اثر (Ne _ He)/ ستون جداسازي(separation column) / محل تزريق نمونه(injection port) / اشکارساز (detector) / ثبات (recorder) / هيتر / ترموستات

ستون گاهي چند متر است بنابراين انرا مارپيچ مي سازند. محل تزريق و ستون بايد گرم شود تا نمونه نيز بخار شده همرا گاز حرکت کند براي از هيتر استفاده مي شود. نمونه هاي جدا شده يکي يکي به اشکارساز ميرسند که به صورت يک پيک يا قله در ثبات نشان داده مي شود.

زماني که طول ميکشد تا max مقدار جسم از ستون خارج شود را زمان بازداري گويند. حجمي از فاز متحرک که باعث مي شود max جسم خارج شود را نيز حجم بازداري مي گويند.

V=FT

که F سرعت عبور است.

مقادير V و T از خصوصيات يک ماده اند و در شرايط ثابت (گاز- دما- فشار-فاز ساکن-طول ستون- اشکارساز و…) ثابت هستند و ارتفاع پيک يا سطح زير پيک به غلظت بستگي دارد, بنابراين مي توان هم تجزيه ي کمي و هم کيفي را انجام داد

منابع:

1-http://daneshnameh.roshd.ir

شيمي عمومي ؛ دکتر غلام رضا قاضي مقدم

شيمي عمومي ؛ بانگرش کاربردي (۲) اسميت اسموت پرايس

فرهنگ شيمي ؛ ديويد ويليام آرتور شارپ