روشهاي صحيح استفاده از دستگاه كروماتوگرافي مايع با كارايي بالا (HPLC)
تهيه فاز متحرك
عدم رعايت اصول صحيح در تهيه و استفاده از فاز متحرك مشكلات فراواني براي سيستم HPLC به وجود مي آورد. بارزترين اين مشكلات عبارتند از:
- جدا شدن گازهاي محلول از فاز متحرك در پمپ ها
- حبس شدن حباب هوا يا ذرات ناخالص در Cell مربوط به دتكتور.
- وجود تركيبات ناخواسته در فاز متحرك
- آسيب رساني به check valve ها و seal wash ها
- گرفتكي In line filter ها، فريت ها و لوله ها
- كاهش دقت حجم تزريق
اين مشكلات ميتوانند از راههاي مختلف كارايي سيستم HPLC را كاهش دهند از جمله از طريق:
- بالا رفتن فشار معكوس
- تلاطم در base line به علت نوسان در جريان فاز متحرك
- عدم تكرار پذيري در زمان بازدارندگي
- غير عادي بودن طيف
- خطا در نتايج كيفي و كمي
براي جلوگيري از بروز مشكلات مي بايد از حلال با خلوص HPLC يا اسپكتروسكوپي استفاده شود. مواد شيميايي مورد نياز جهت تهيه فاز متحرك و آماده سازي نمونه ها و استانداردهاا بايد داراي خلوص بالا باشند.
كليه حلالهاي مورد نياز جهت تهيه فاز متحرك، بخصوص نمك ها و بافرها، بايد از صافي 0.45 ميكرون عبور داده شوند. دقت شود كه نوع صافي با حلال مورد نظر سازگار باشد. پس از صاف كردن، در ظرف مناسب درب دار نگهداري شود.
دقت عمل در تهيه فاز متحرك بسيار مؤثر است. به عنوان مثال به جاي اندازه گيري حجم از توزين استفاده شود.
فقط از آب خالص با مقاومت 18 مگا اهم استفاده شود و فاز متحرك در ظرف شيشه اي نگهداري شود. قبل از استفاده ظروف نگهداري با فاز متحرك شستشو داده شوند. از مواد شوينده استفاده نشود و اگر مورد استفاده قرارگرفت، بلافاصله با آب HPLC و سپس با متانول شستشو داده و با هوا خشك شود.
و سپس با متانول شستشو داده و با هوا خشك شود.
هواگيري ناقص فاز متحرك سبب بيش از 70 درصد مشكلات در HPLC مي باشد. انجام هواگيري مناسب مزاياي زير را به دنبال دارد.
- تكرارپذيري زمان بازداري
- پبات در عملكرد پمپ ها
- پبات خط پايه
معمولاً از يك يا چند روش زير جهت هواگيري فاز متحرك استفاده مي شود:
- فيلتر كردن در خلاء
- استفاده از سونيكيت
- هواگيري با جريان مداوم گاز خنثي مثل هليوم (Sparging)
در ابتداي مسير حلال حتماً از solvent inlet filter استفاده شود. نصب كرد يك شيلنگ جريان ازت بر روي
سطح حلال باعث جلوگيري از انحلال مجدد هوا در فاز متحرك مي شود.
حلال هاي فاز متحرك نبايد در طول موج تنظيم شده براي آشكارساز جذب نوري، داراي جذب باشند.
جهت جلوگيري از رشد قارچ ها و باكتري ها رعايت نكات زير ضروري مي باشد:
- تهيه فاز متحرك، فيلتر و هواگيري آن براي هر روز كاري تكرار شود.
- نگهداري فاز متحرك در ظروف شيشه اي تيره رنگ صورت بگيرد.
- در صورتيكه قرار باشد سيستم HPLC به مدت طولاني غير فعال باشد، ابتدا كل سيستم با آب خلوص HPLC شستشو داده و سپس با مخلوطي از حداقل 10 درصد حلال آلي ( متانول يا استونيتريل) و آب HPLC شستشو داده شود.
- در مواقعي كه سيستم HPLC غير فعال باشد، آب HPLC يا بافر به تنهايي داخل آن نباشد.
- باقي مانده حلالهاي فاز متحرك كه قديمي شده باشد استفاده نشود و فاز متحرك جديد تهيه شود.
- در صورتي كه فاز متحرك حاوي بافر باشد، سيستم HPLC به طور مرتب با آب خلوص HPLC شستشو داده شود تا از تشكيل رسوب نمكهاي بافر جلوگيري شود.
- جهت تغيير فاز متحرك از حلال آبي به بافر، حتماً از فاز ميانه اي مثل آب با خلوص HPLC استفاده گردد.
- فازهاي متحرك كه از مخلوط كردن حلالهاي آلي با بافر تشكيل ميشودبايد پس از تهيه فيلتر شوند زيرااحتمال تشكيل رسوب وجود دارد.
- براي احاطه بهتر به خواص حلالهاي فاز متحرك از جداول خواص فيزيكي و شيميايي (گرانروي، نقطه جوش، قابليت امتزاج با ديگر حلالها …) استفاده شود.
آماده سازي و كنترل نمونه ها
- ابتدا كنترل چشمي جهت بررسي شفافيت نمونه، عدم وجود رسوب و همگن بودن آن انجام شود.
- بررسي اطلاعات مربوط به نمونه: نوع زمينه، PH نمونه، غلظت املاح آن انجام شود
- قبل از تزريق، نمونه ها بايد توسط صافي هاي يكبار مصرف 22 يا 0.45 ميكرون صاف شوند.
- نمونه هاي غليظ حتماً رقيق شوند
- در صورتيكه نمونه ها بسيار رقيق باشند، بايد روش آماده سازي نمونه ها طوري تنظيم شود كه غلظت بالاتري به دست آيد و به حداقل تشخيص آشكارساز برسد
- در بسياري از موارد، بخصوص نمونه هاي زيستي و عصاره هاي مواد طبيعي، تعداد مواد مخلوط در نمونه خيلي زياد است و فازهاي ثابت كروماتوگرافي توانايي جداسازي همه تركيبات از همديگر را ندارند. لذ انجام پاكسازي نمونه در مرحله آماده سازي ضروري مي باشد.
- در بعضي موارد آماده سازي خوب سبب افزايش كيفيت كروماتوگرافي ( منحني با قرينه بهتر) مي شود.
- آماده سازي صحيح نمونه بر جنبه اقتصادي تجزيه كراماتوگرافي تأثير دارد، زيرا در صورتيكه غلظت نمونه كمتر از حداقل توانايي آشكارساز باشد و يا غلظت مواد ناخواسته زياد باشد، آناليز كراماتوگرافي با شكست مواجه مي شود.
- در اغلب موارد زمينه اصلي نمونه پس از انجام مراحل آماده سازي نمونه، تغيير پيدا ميكند.
- در عين حال كه آماده سازي نمونه ضروري است ولي بايد سعي شود مراحل آن به حداقل برسد، تعدد مراحل سبب افزايش خطاي تجزيه مي شود.
نگهداري از ستون HPLC
مهمترين عواملي كه در حفظ و كارايي ستون HPLC به ما كمك مي كند به شرح ذيل مي باشند.
- هميشه به محدوده مجاز PH براي ستون توجه شود. به عنوان مثال براي ستون هاي فاز معكوس C18 از جنس سيليكا خارج از محدوده 7/5-2 نبايد استفاده شود.
- از تغييرات ناگهاني در عبور جريان فاز متحرك و فشار داخل سيستم HPLC جلوگيري شود.
- فاز متحرك فقط پس از فيلتراسيون و هواگيري از ستون عبور داده شود.
- در مرحله آماده سازي نمونه ها از روش هاي پيشرفته مانند استخراج با فاز جامد (ستون هاي SPE) استفاده شود.
- جهت كاهش آلودگي ستون از محافظ ستون استفاده شود.
- قبل از خاموش كردن سيستم HPLC، ستون با يك حلال مناسب شستشو داده شود.
- زماني كه ستون بلا استفاده است آن را در يك حلال مناسب نگهداري كنيد. به عنوان مثال براي ستون هاي فاز معكوس C18 در مخلوطي از حلال آلي متانول يا استونيتريل و آب HPLC با نسبت 80-20 يا استونيتريل خالص نگهداري شود.
- بالا رفتن فشار معكوس ستون علامت خوبي براي زمان تعويض محافظ ستون مي باشد.
- موقع راه انداختن سيستم HPLC، به خصوص زمانيكه سيستم مدت طولاني بلا استفاده مانده است، ابتدا ستون فاز معكوس را با حلال آلي ( متانول يا استونيتريل) به مقدار 20-10 بار معادل حجم ستون، جهت فعال كردن گروههاي پيوند داده شده، شستشو داده سپس فاز متحرك عبور داده شود.
- جريان فاز متحرك به تدريج افزايش يابد تا از تغيير ناگهاني فشار داخل سيستم HPLC جلوگيري شود.
- شستشو با فاز متحرك تا رسيدن به خط پايه يكنواخت و متعادل بايد ادامه يابد.
