محاسبه حد تشخیص LOD و حد تعیین کمی LOQ

حد تشخیص (LOD): کوچکترین غلظتی است که یک روش می‌تواند با درجه اطمینان مشخصی آن را تشخیص دهد.‏

حد کمی شدن (LOQ): حدی است که در آن می‌توانیم به طور منطقی اختلاف بین 2 مقدار مختلف را تشخیص داهیم.‏ حد کمی شدنیک روش کوچکترین غلظت آنالیت بوده که می‌توان آن را با عدم‌قطعیت قابل قبولی تعیین نمود.‏

به منظور درک بهتر مفهوم حد تشخیص و حد کمی شدن به این مثال توجه نمایید. فرض کنید شما در یک فرودگاه نشسته‌اید که ‏سر و صدای زیادی ناشی از نشستن و برخاستن هواپیماها در آن وجود دارد. اگر فردی که در نزدیک شما نشسته است به آرامی صحبت کند، ‏شما صدای وی را نمی‌شنوید. صدای وی کمتر از ‏LOD‏ می‌باشد. اگر او کمی بلندتر صحبت کند، شما صدای او را می‌شنوید، ولی متوجه ‏حرفی که می‌زند، نمی‌شوید. در این حالت صدای وی بزرگتر از ‏LOD‏ ولی کمتر از ‏LOQ‏ می‌باشد. اگر وی باز هم بلندتر صحبت کند، شما ‏منظور او را متوجه شده و به او جواب می‌دهید. در این حالت صدای وی از ‏LOD‏ و ‏LOQ‏ بزرگتر می‌باشد.‏

در اصطلاح کلی، حد تشخیص غلظتی که در آن سیگنال دستگاه y‎‏ دارای اختلاف قابل توجهی از سیگنال نمونه شاهد باشد.‏

تمایز بین حد تشخیص دستگاه و حد تشخیص روش آزمون

تمایزگذاری بین حد تشخیص دستگاه و حد تشخیص متد نیز ضروری است. حد تشخیص دستگاه می تواند بر پایه آنالیز یک نمونه پایه گذاری شود که اغلب واکنشگر بلانکی است که به طور مستقیم (یعنی هرگونه مراحل تهیه نمونه در آن حذف شده) یا به صورت نسبت سیگنال به نویز، برای مثال یک کروماتوگرام به دستگاه معرفی می شود.

جهت دستیابی به حد تشخیص متد LOD، می‌بایست بر اساس آنالیز نمونه‌هایی که تمام مراحل روش اجرایی اندازه‌گیری را پشت سر گذاشته اند و استفاده از نتایج محاسبه شده با معادله یکسان برای نمونه‌های آزمایشی، پایه گذاری شود. این روش حد تشخیص، مفیدترین روش صحه گذاری متد می باشد.

تعیین انحراف استاندارد در سطوح پایین:

LOD و LOQ، معمولاً با ضرب انحراف استاندارد (s’_۰) در یک فاکتور مناسب محاسبه می‌شوند. مهم است که این انحراف استاندارد، نماینده دقت به دست آمده برای نمونه‌های آزمایشی نوعی باشد و اندازه گیری‌های تکراری کافی نیز جهت ارائه تخمین مناسب در آن لحاظ شده باشد.

نمونه‌های مناسب برای تخمین LOQ و LOD:

نمونه‌های : استفاده شده می‌بایست ترجیحاً یا الف) نمونه‌های بلانک، یعنی ماتریکس‌هایی که شامل آنالیت غیرقابل تشخیص هستند و یا ب) نمونه‌های آزمایشی با غلظت‌های آنالیت نزدیک به LOD و یا زیر LODمورد انتظار باشند. نمونه‌های بلانک برای متدهایی که در آنها یک سیگنال قابل اندازه‌گیری برای یک بلانک به دست می‌آید، مثل اسپکتروفتومتری و اسپکتروسکوپی اتمی مناسب می‌باشند. با این حال، برای تکنیک‌هایی نظیر کروماتوگرافی که مبتنی بر تشخیص پیک بالای نویز می‌باشد، نمونه‌هایی با سطوح غلظت نزدیک LOD یا بالای LODنیاز می‌باشند. این نمونه‌ها را می‌توان برای مثال با، نشانه‌ گذاری یک نمونه بلانک تهیه کرد.

وقتی نمونه‌های بلانک یا نمونه‌های آزمایشی در غلظت‌های پایین در دسترس نباشند، اغلب بلانک‌های واکنشگر استفاده می‌شوند. چنانچه این بلانکهای واکنشگر کل روش اجرایی اندازه گیری را پشت سر نگذاشته و به طور مستقیم به دستگاه معرفی شوند، محاسبه انجام شده بر پایه این اندازه گیری‌ها LOQ/LODدستگاه را ارائه خواهد داد.

پوشش‌دهی دامنه‌ی کاربرد متد: برای متدهای با دامنه پوششی ماتریکس‌های بسیار متفاوت، ممکن است تعیین انحراف استاندارد هر ماتریکس به طور جداگانه الزامی باشد.

تضمین تکرار نمایندگی: انحراف استاندارد می‌بایست نماینده عملکرد متد، به همان شکلی باشد که در آزمایشگاه استفاده می‌شود، یعنی انحراف استاندارد می‌بایست بر اساس نتایج آزمایشی محاسبه شود که در آنها، آنالیزها دقیقاً مطابق با روش اجرایی اندازه گیری مستند شامل تمام مراحل تهیه نمونه انجام شده باشند. مقادیر استفاده شده برای محاسبه انحراف استاندارد S_۰می‌بایست مطابق با واحدهای، اندازه گیری مشخص در روش اجرایی باشند.

شرایط اندازه گیری: معمولا انحراف استاندارد تحت شرایط تکرارپذیری به دست می‌آید و این روش در این پست توضیح داده میشود. با این حال، تخمین قابل اعتمادتر می‌تواند با استفاده از شرایط دقت میانی به دست آید.

تعداد مشاهدات: تعداد تکرارها (m) جهت دستیابی به تخمین رضایتبخش از انحراف استاندارد می‌بایست کافی باشند. نوعاً بین ۶ تا ۱۵ تکرار لازم است. اغلب در روش‌های اجرایی/ پروتوکل‌های صحه گذاری ۱۰ تکرار پیشنهاد می‌شود.

محاسبه معدل گیری: در بسیاری از روش‌های اندازه‌گیری، میانگین تکرارها در استفاده روتین متد گزارش می‌شود. در اینجا هر تکرار با اجرای کل روش اندازه‌گیری به دست می‌آید. در این حالت، انحراف استاندارد نتایج تک، S_۰می‌بایست با تقسیم بر ریشه‌ی دوم n تصحیح شود. در اینجا ، n تعداد تکرارهای معدل گیری شده در استفاده روتین، می‌باشد.

محاسبه اثر تصحیح‌های بلانک: اگر تصحیح‌های بلانک در روش اندازه‌گیری مشخص شده باشند، آنگاه می‌بایست در تعیین انحراف استاندارد برای محاسبه LOD یا LOQ احتیاط شود. اگر در مطالعه صحه‌گذاری، تمام نتایج با مقدار بلانک یکسان تصحیح شده به دست آیند رویکردی که در اینجا برای سادگی ارائه شده آنگاه انحراف استاندارد نتایج در مقایسه با زمانی که در عمل، نتایج با مقادیر بلانک تصحیح شده متفاوت در اجراهای مختلف به دست می‌آیند، کوچکتر خواهد بود. در این مورد so می‌بایست با ضرب در مقدار  تصحیح شود. در اینجا n تعداد مشاهدات تکراری، معدل گیری شده هنگام گزارش نتایج است، وقتی که هر تکرار با دنبال کردن کل روش اندازه گیری به دست آید و nb تعداد مشاهدات بلانک استفاده شده برای محاسبه ، تصحیح بلانک می‌باشد. توجه داشته باشید که تحت شرایط دقت میانی، نتایج، با مقادیر بلانک متفاوت تصحیح خواهند شد، لذا هیچ تصحیحی برای انحراف استاندارد لازم نمی‌باشد.

نمودار: محاسبه انحراف استاندارد، S’0 که می‌بایست برای تخمین LOQ و LOD استفاده شود. فلوچارت با انحراف استاندارد آزمایشی، S0 شروع شده که تحت شرایط تکرارپذیری از نتایج اندازه گیری‌های تکراری روی نمونه نزدیک به غلظت صفر، محاسبه می‌شود. در اینجا یا تصحیح بلانک انجام نشده و یا تصحیح بلانک برای تمام نتایج مشخص شده در متد اعمال خواهد شد. تصحیح بلانک ممکن است بر اساس یک مشاهده بلانک تک یا بر اساس میانگین چندین مشاهده بلانک پایه گذاری شده باشد.

مثال: یک تمرین صحه گذاری بر پایه آنالیز بلانک نمونه بنا نهاده شده است. تعداد ده (m) اندازه گیری مستقل از بلانک نمونه تحت شرایط تکرارپذیری انجام می‌شوند. نتایج دارای مقدار میانگین ۲mg/kg و انحراف استاندارد S0 1mg/kg می‌باشند.

حالت ۱- روش اندازه گیری بیان می‌کند که نمونه‌های آزمایشی می‌بایست یک بار (n=1) اندازه گیری شده و نتایج با نتیجه به دست آمده برای نمونه بلانک نمونه تک (n_b=۱) تصحیح شوند. در یک سری از اندازه گیری‌ها، هر اجرا شامل تکرارهای تک نمونه‌های روتین و یک نمونه بلانک (n_b) می‌باشد. در این حالت انحراف استاندارد برای محاسبه LOD/LOQ مطابق با نمودار بالا برابر خواهد شد با:

حالت ۲- روش اندازه‌گیری بیان می‌کند که نمونه‌های آزمایشی می‌بایست در دو تکرار (n=2) همچنین نمونه‌های بلانک هم در دو تکرار آنالیز شوند. در یک سری از اندازه‌گیری‌ها، هر اجرا شامل دو بارتکرار (n=2) نمونه‌های روتین و دو نمونه بلانک (nb=2) می‌باشد. غلظت به دست آمده برای نمونه‌های روتین با کم کردن مقدار میانگین دو نمونه بلانک تصحیح می‌شود. در این حالت، انحراف استاندارد برای محاسبه LOD/LOQ طبق نمودار بالا، برابر، خواهد شد با:

تخمین LOD

برای اهداف صحه گذاری، معمولاً بیان مقدار تقریبی، LOD یعنی سطحی که در آن تشخیص آنالیت مشکل ساز می‌شود، کافی است. بدین منظور از رابطه زیر استفاده می‌شود در این رابطه B1 شیب خط منحنی کالیبراسیون خواهد بود:

اگر شیب منحنی کالیبراسیون برابر با یک باشد (B_۱=۱) رابطه فوق به صورت زیر در خواهد آمد:

تخمین LOQ

پایین ترین سطح آنالیت است که می‌تواند با عملکرد قابل قبول تعیین شود ” عملکرد قابل قبول” به اشکال مختلف، در راهنماهای مختلف، شامل دقت، دقت و درستی یا عدم قطعیت اندازه گیری میباشد. با این حال، در عمل LOQ در بیشتر قراردادها به صورت غلظت آنالیت، مطابق با انحراف استاندارد به دست آمده S’_۰ در سطوح پایین با ضرب در فاکتور k_Q محاسبه می‌شود. مقدار پیش، فرض آیوپاک برای k_Q رقم ۱۰ است.

اگر شیب منحنی کالیبراسیون برابر با یک باشد (B_۱=۱) رابطه فوق به صورت زیر در خواهد آمد: